Содержание:
Введение
Типы питательных сред
Жидкие питательные среды
Твердые питательные среды
Заключение
Список литературы
Под питательными средами подразумевают различного рода субстраты, приготовляемые для изучения жизнедеятельности микроорганизмов при определенных условиях, изменяемых по воле экспериментатора. Микрохимические анализы и опыты искусственной культуры выяснили потребность бактерий в питательных веществах. Согласно этим указаниям и составляются питательные среды. Существенным условием при этом является определенное содержание воды. Сухие органические вещества не заселяются микробами; соление консервирует мясо, отнимая у него известное количество воды. Первенствующее значение для жизнедеятельности микроорганизмов имеет затем реакция питательной среды; для большинства бактерий она должна быть нейтральной или слабощелочной, рост холерного вибриона прекращается уже при слабокислой реакции. Вас. erythosporus и micrococcus aquatilis размножаются даже в дистиллированной, 2 раза перегнанной воде, удовлетворяясь, очевидно, тем ничтожным количеством органических веществ, какое содержится и в чистой перегнанной воде, или, быть может, питаясь за счет азота и углерода атмосферного воздуха. Некоторые микроорганизмы заимствуют нужный им для питания азот из аммиачных или азотнокислых соединений, другие безусловно требуют наличности в питательной среде белковых веществ.
Большинство болезнетворных микроорганизмов хорошо растут в бульоне, мясопептонной желатине и на агаре; другие, наоборот, нуждаются в питательной среде (кровяной сыворотке, агаре, смазанном кровью, и т.п.), по составу своему приближающейся к составу тканей и соков животного организма.
Некоторые строго паразитные бактерии совершенно не выращиваются на мертвом субстрате, размножаясь лишь в организме живого существа и даже иногда определенного животного. До сих пор не удается культивировать на какой-либо искусственной питательной среде лепрозную палочку, некоторые слюнные бактерии, спирохету возвратной горячки и др.
Питательные среды бывают жидкие и твердые. Главное преимущество жидких сред заключается в возможно равномерном распределении в них зародышей; этим дается возможность всегда работать с точно отмеренным количеством бактерий, что особенно важно при опытах с впрыскиванием последних животным для изучения силы болезнетворного действия микрофитов. Разводка микроорганизма в жидкой среде, введенная в полое предметное стекло, дает нам возможность изучить непосредственно под микроскопом рост и деление клеток, образование микрофитом различных сочетаний, появление в нем спор и их прорастание. Бульонные культуры патогенных бактерий, освобожденные соответственной фильтрацией от живых зародышей, представляют чистые растворы продуктов вещественного обмена микроорганизмов, различного рода бактерийные яды (токсины), знакомство с которыми имеет первенствующее значение для уразумения сущности заразных болезней. Разводки в молоке, пептонной воде и др. дают нам ценные указания для биологической характеристики многих микроорганизмов, для отличия их друг от друга. Жидкими средами можно пользоваться, однако, лишь тогда, когда в распоряжении имеется уже чистая разводка того или другого микроорганизма; разъединение же зародышей, вылавливание одного из них из той смеси различнейших видов бактерий, которая встречается в окружающей нас природе, возможно лишь при помощи плотного субстрата, консистенция которого препятствует смешиванию между собой различных микроорганизмов, растущих здесь совершенно особняком и на надлежащем друг от друга расстоянии. Неожиданно быстрое развитие, достигнутое бактериологией в последние 10 - 15 лет, главным образом обязано введению Р. Кохом в бактериологическую технику твердых прозрачных субстратов. Питательные среды до посева исследуемого микроорганизма должны быть тщательно обеспложены, с целью устранения случайно поселившихся в них посторонних бактерий.
Мясопептон-бульон. 500 г мяса, освобожденного от жира, костей, сухожилий и апоневрозов и пропущенного через мясорубку, обливают литром дистиллированной воды, после чего смесь оставляется для полного выщелачивания в прохладном месте. Через сутки получившийся настой пропускают через несколько слоев марли, сильно выжимая при этом задерживаемое марлей мясо, до получения 1 литра мясной воды; к последней прибавляют 10 г пептона и 5 г поваренной соли и затем жидкость кипятят с 3/4 часа на голом огне до полного свертывания всех нерастворимых белков, после чего она охлаждается и фильтруется. Полученный кислый бульон (свежее мясо обладает кислой реакцией) нейтрализуется едким натром до слабощелочной реакции, кипятится затем ровно 5 минут и в горячем виде отфильтровывается. Разливают готовый бульон в колбочки, пастеровские ballons-pipettes или в пробирки и стерилизуют нагреванием в коховском текучепаровом аппарате в течение 2 часов или в папиновом котле (при 115°) в течение 15 минут. Вместо мяса для приготовления мясопептон-бульона пользуются также готовым мясным экстрактом Либиха, что значительно упрощает дело. На 1 литр воды берут 30 г пептона, 5 г виноградного или тростникового сахара и столько же экстракта. Жидкость подвергается продолжительному кипячению и после полного охлаждения пропускается через толстый слой животного угля, насыпанного в обыкновенный фильтр из шведской бумаги. Этим путем удается получить прозрачный и неокрашенный субстрат. - Мясопептон-бульон употребляется или сам по себе, как прекрасная среда для питания и размножения многих сапрофитов и болезнетворных микроорганизмов, или как исходный материал для приготовления твердых субстратов. В бульонных разводках обращают внимание, остается ли жидкость в главной своей массе чистой, или она помутнела. Неподвижные бактерии, размножаясь в бульоне, опускаются на дно пробирки в виде облачка, хлопьев или порошковидного осадка; обладающие же самостоятельным движением вызывают равномерное помутнение жидкости, осаждаясь лишь впоследствии. Образование пленки на поверхности бульона позволяет в грубых чертах судить о степени потребности засеянного микроорганизма в кислороде. Прибавлением к бульону 6-8% глицерина получается среда, весьма благоприятная для бугорчатых палочек, разрастающихся здесь на поверхности в виде толстых, складчатых пленок; особенно пригоден для этой цели бульон (с глицерином), приготовленный из телячьих легких.
Пептонная вода. Многие микроорганизмы вырабатывают из белковых веществ ароматические основания - главным образом индол, отчасти также фенол, скатол и тирозин; другие (холерный вибрион) одновременно с индолом вырабатывают также и азотистые продукты. Индоловая реакция служит для отличия друг от друга некоторых бактерий. Она получается лишь при наличности в питательной среде пептонов; присутствие сахара вредит реакции, а потому для получения последней пользуются чистым раствором панкреатического пептона или, что проще, нейтрализованным раствором пептона (1%) и поваренной соли (0,5%) в воде.
Молоко весьма часто употребляется для испытания способности микроорганизма разлагать молочный сахар с выделением кислот (молочной, уксусной и др.), свертывающих молоко; одни микроорганизмы свертывают молоко, другие этой способностью не обладают. Молоко, даже только что выдоенное, весьма нередко содержит споры, упорно противостоящие высокой температуре, а потому обеспложивание его требует особенной тщательности. Нагревают его 1/4 часа в автоклаве при 120°; но так как вследствие карамелизации сахара при такой высокой температуре оно нередко буреет и вообще несколько изменяется в своих свойствах, то рациональнее стерилизовать молоко четыре дня подряд, по 1/2 часа, в коховском текучепаровом аппарате.
Молочную сыворотку предложил Petruschky для определения количества вырабатываемых бактериями свободных щелочей и кислот. Совершенно свежее молоко, разбавленное равным объемом воды, слегка нагревается, после чего к нему прибавляют разведенной соляной кислоты в количестве, достаточном для выпадения казеина, который затем отфильтровывается. Жидкость нейтрализуется содой, нагревается часа 2 в аппарате Коха и снова фильтруется от выпадающего при нагревании последнего остатка казеина. Получающаяся сыворотка должна быть строго нейтральной реакции и прозрачна как вода, лишь с легким желтовато-зеленым оттенком. По прибавлении к жидкости чувствительной лакмусовой настойки ее разливают в пробирки совершенно одинакового размера и стерилизуют 3 дня подряд при 100°.
Безбелковые питательные растворы. Пастер еще в 1858 г. показал, что дрожжевые грибки для своего роста не нуждаются в белковых веществах, заимствуя, подобно зеленым растениям, нужный им азот из аммиака. Предложенная Пастером безбелковая жидкость изменена была Мейером, Коном, Ушинским и К. Френкелем. Раствор последнего (0,5% поваренной соли, 0,2% двуфосфорнокислого калия, 0,6% молочнокислого аммония, 0,1% аспарагина) дает весьма благоприятные условия для роста многих гнилостных и патогенных бактерий. Особенное место между безбелковыми питательными средами занимает жидкость Капальди и Проскауера, представляющая одно из драгоценнейших средств для отличия друг от друга брюшнотифозной палочки и bac. coli communis, как известно, сходных между собою по морфологическому характеру, неспособностью окрашиваться по Грамму и одинаковому росту на желатине и агаре. Жидкость эта готовится растворением в 100 куб. см воды 0,2 аспарагина, 0,2 маннита, 0,02 хлористого кальция и 0,02 двукислого фосфорнокислого натрия. Она нейтрализуется щелочью и после прибавления к ней лакмуса стерилизуется. Тифозная палочка для удовлетворения потребности в азоте безусловно нуждается в белковых веществах, а потому и не растет в этой жидкости и не изменяет ее реакции; кишечная же палочка менее требовательна к питательным средам, нужный ей для питания азот она берет из амидных соединений (аспарагина, креатина, сукцинамида и др.) и даже из аммиачных солей некоторых органических и минеральных кислот, а потому, в противоположность тифозной палочке, хорошо размножается в питательных средах Капальди и Проскауера и благодаря разложению маннита сообщает ей через 20 часов резко кислую реакцию.
Куриные яйца в сыром виде представляют питательную среду, состоящую из живого белка. Свежие яйца тщательно очищаются снаружи мылом, обмываются обеспложенной водой и обтираются обеспложенной ватой. В одном из полюсов яйца прокаленной иглой делается точечное отверстие, через которое глубоко вводится на платиновой проволоке заразный материал. Отверстие закрывается каплей растопленного сургуча.
Водянистая влага глаза имеет важное значение для изучения под микроскопом хода развития микроорганизмов. Для получения ее вынимают глаз только что убитого животного, прижигают роговицу раскаленной стеклянной палочкой, прокаливают прижженное место острием стерилизованной пастеровской пипетки, в которую при легком давлении на глазное яблоко и поступает humor aqueus. Вынимают пипетку и запаивают кончик ее на пламени. Жидкость сохраняется до востребования.
Твердые питательные среды распадаются на прозрачные (мясопептон-желатина, мясопептон-агар, кровяная сыворотка и др.) и непрозрачные (картофель, рис, хлебная мезга и пр.).
Прозрачные питательные среды:
Мясопептонная желатина. К бульону, приготовленному вышеописанным способом, прибавляют листовой, лучшего качества желатины в количестве 5% зимой и 10-12% в теплое время года. При постоянном помешивании жидкость нагревается до полного растворения желатины, после чего прибавлением щелочи придают ей нейтральную или слабощелочную реакцию (продажная желатина обладает кислой реакцией). Жидкость кипятится 1/4 часа, вновь становясь нередко слабокисловатой, почему новым добавлением щелочи восстановляют ее прежнюю реакцию. Для лучшего просветления жидкости ее предварительно охлаждают до 40-50° С, прибавляют тщательно взбитый с водой яичный белок и снова подвергают ее сильному кипячению в течение 20 минут; при этом белок, свертываясь в виде плотных комков, захватывает мельчайшие частицы, вызывающие мутноватость желатины. Остается профильтровать желатину. Для отделения плотных комков яичного белка ее пропускают предварительно через несколько слоев марли, после чего она подвергается фильтрации через смоченный кипятком складчатый фильтр из шведской бумаги. Стеклянная воронка с фильтром помещается в другую плантамуровскую воронку, в которой между двойными станками находятся горячая вода, благодаря чему фильтрование, совершающееся при высокой температуре, происходит довольно быстро и желатина не застывает на фильтре. Процеженная желатина должна быть совершенно прозрачна, слегка лишь окрашена и нейтральной или слабощелочной реакции; она разливается в пробирки и обеспложивается три дня подряд по 20 мин. в коховском аппарате. Продолжительное, в течение нескольких часов, кипячение желатины с целью ее стерилизации не допускается, так как она теряет при этом способность застывать.
Мясопептон-агар. Агар представляет собой растительный студень, добываемый из растущих в Ост-Индии и Японии различного рода водорослей; он распускается лишь при температуре, близкой к точке кипения воды, и снова застывает уже при 40° С; благодаря своей тягучести он даже в 40° С растворе фильтруется с большим трудом, почему при приготовлении из агара питательной среды