Регуляция биосинтеза белков на этапе трансляции
До недавнего времени считалось, что регуляция на уровне трансляции характерна почти исключительно для эукариот, где существует временное и пространственное разобщение транскрипции и трансляции в связи с наличием оболочки ядра и формированием долгоживущих, «защищенных» белками иРНК информосом, открытых А.С. Спириным.
Косвенным указанием на существование регуляции трансляции у прокариот является различие в скорости образования некоторых белков, кодируемых одним и тем же регулоном и транслируемых с общей полицистронной матрицы, как, например, в случае субъединиц РНКП и некоторых рибосомных белков.
Существует потенциальная возможность регуляции скорости трансляции на двух этапах: на этапе биосинтеза и сборки компонентов аппарата трансляциии и на этапе их функционирования.
Регуляция на этапе биосинтеза и сборки компонентов аппарата трансляции
Основными высокомолекулярными компонентами аппарата трансляции являются аминоацил-тРНК-синтетазы, транспортные РНК, рибосомные РНК, информационные РНК, рибосомные белки и белковые факторы трансляции.
Аминоацил-тРНК-синтетазы представляют собой довольно крупные белки, чаще всего мультимерные. Число их видов равно числу природных аминокислот. Уровень всех или большинства АРСаз регулируется координирование и пропорционален скорости роста. Избыток аминокислот не оказывает на синтез АРСаз прямого репрессирующего действия. Значительная часть АРСаз эукариот ассоциирована с полирибосомами и организована в полиферментные комплексы. Поэтому в отношении их действуют регуляторные механизмы, характерные для управления активностью ферментных ансамблей.
Транспортные РНК составляют около 10–15% всей клеточной РНК и кодируются 50–60 генетическими локусами. Биосинтез тРНК проходит промежуточное образование предшественников, которые затем укорачиваются и модифицируются – явление, называемое процессингом, или «созреванием» тРНК. Например, предшественник тирозиновой транспортной РНК у Escherichia coli содержит 129 нуклеотидов, это на 44 нуклеотида больше, чем «зрелая» форма. Такой предшественник можно выделить из температурочувствительного мутанта с дефектом РНКаз. Он подвергается процессингу с участием двух РНКаз: Р и PIII. Необходимо отметить, что РНКаза Р состоит из РНК и белка, причем РНК сама по себе может выполнять функции фермента, катализируя процессинг, тогда как белок только стимулирует ее активность. Таким образом, РНКаза Р является пока не очень многочисленным примером рибозима, т.е. фермента, представляющего собой не белок, а РНК.
Следующим этапом процессинга многих тРНК является модификация оснований, которая осуществляется при помощи большого количества ферментов, поскольку даже одна и та же модификация основания, находящегося в разных участках молекулы тРНК, может осуществляться разными ферментами.
Важно отметить, что в процессе эволюции количество модифицированных компонентов в тРНК возрастало. Это указывает на важную регуляторную роль модифицированных изоакцепторных тРНК. Далее рассмотрим гипотезы, касающиеся возможных механизмов регуляции трансляции, основанных на использовании изоакцепторных тРНК.
Рибосомные РНК у эукариот представлены четыремя типами.» 28S, 18S, 5,8S и 5S, у прокариот тремя: 23S, 16S и 5S. Кроме того, в митохондриях и хлоропластах эукариот содержатся рибосомы, близкие по составу к прокариотическим. Геном Escherichia coli содержит 6–7 оперонов, включающих локусы всех трех рРНК, а также разное число локусов тРНК. В процессе транскрипции синтезируется общий транскрипт, подвергающийся процессингу, который осуществляется в ходе транскрипции, так что общий транскрипт длиной 5600 нуклеотидов может быть выделен только в системе in vitro или у мутантов с дефектом РНКаз. РНКаза III «узнает» двунитевые участки, соответствующие границам локусов транскрибируемых РНК. После действия РНКазы III образуются не «зрелые» молекулы РНК, а их предшественники, которые подвергаются дальнейшему про-цессингу. В случае рРНК он может состоять, например, в метилировании, которое обычно осуществляется после того, как рРНК включена в состав субчастицы рибосомы.
У некоторых эукариот процессинг 28S РНК состоит в удалении «лишнего» фрагмента посредством аутосплайсинга, при котором РНК выполняет роль «псевдофермента», катализирующего собственный процессинг в отсутствие белков-ферментов.
Ступенчатый процессинг позволяет осуществить регуляцию на каждом из этапов биосинтеза и сборки, а указанная организация локусов обеспечивает образование всех рРНК в равных соотношениях.
Синтез рРНК и рибосомных белков регулируется координирование и определяется эффективностью роботы аппарата трансляции: например, при дефиците аминокислот транскрипция локусов, кодирующих рРНК и рибосомные белки, подавляется одновременно. Подробнее об этом будет рассказано в главе, посвященной регуляции скорости роста.
Информационная РНК у прокариот, как правило, полицистронна, а у эукариот – моноцистронна. Процессинг у эукариот состоит в вырезании интронов и в сплайсинге экзонов. Затем происходит метилирование оснований. На конце 5 достраивается специфическая группировка, так называемый «кэп», а на конце 3 последовательность из остатков адениловой кислоты, включающая до 100–400 нуклеотидов. Роль этой последовательности остается неясной. Поступившая в цитоплазму иРНК существует в виде нукле-опротеидного комплекса – информосом и в таком виде может сохраняться длительное время до наступления трансляции.
Для прокариот процессинг иРНК не характерен, хотя в некоторых иРНК архебактерий также обнаружены интроны, а у Escherichia coli полицистронный транскрипт локуса, включающего гены рибосомных белков LI, L7, L12 и гены, содержащие от 5 до 180 остатков адениловой кислоты. Показано, что они наиболее характерны для секретируемых белков.
Практически отсутствуют сведения о регуляции образования белковых факторов трансляции. У прокариот это факторы инициации, элонгации, терминации. У эукариот их больше, они сложнее по строению: только факторов инициации насчитывается свыше восьми, зато фактор терминации всего один.
По полученным за последнее время сведениям, некоторые из этих факторов способны модифицироваться; например, у эукариот может происходить фосфор ил ирование фактора инициации eIF‑2 и фактора элонгации EF‑1, а также ADP‑рибозил ирование фактора EF‑2, что, несомненно, влияет на скорость процесса трансляции. В случае прокариот обнаружено метилирование фактора элонгации EF-Tu Escherichia coii, однако регуляторное значение этого процесса неизвестно.
Регуляция на этапе функционирования аппарата трансляции
Регуляция может осуществляться как на этапе инициации, так и этапе элонгации.
1. Регуляция инициации. У прокариот регуляция инициации трансляции осуществляется путем специфического связывания регуляторных белков с инициаторным районом иРНК, в результате чего трансляция подавляется. Такая регуляция существует при развитии фага MS2, в процессе которого белок оболочки регулирует трансляцию матрицы РНК-репликазы. Аналогичный механизм действует при регуляции трансляции рибосомных белков Escherichia coii. Гены 52 рибосомных белков организованы в 16 оперонов, в ряде случаев они объединены с локусами компонентов РНКП и факторов трансляции, и для поддержания их независимого и координированного синтеза необходим механизм «обратной связи», в результате функционирования которого избыток рибосомных белков подавляет собственную трансляцию. Иногда рибосома обнаруживает разное сродство к инициаторным участкам разных иРНК, благодаря этому инициация может также регулироваться самой рибосомой. Эта особенность бывает постоянной или регулируется специальными факторами, в результате обеспечивается дифференциальная скорость трансляции разных локусов полицистронной матрицы иРНК.
В некоторых специализированных эукариотических клетках двухцепочечная РНК ингибирует трансляцию, вызывая активацию протеинкиназы, фосфорилирующей фактор инициации eIF‑1.
Описана также возможность блокирования трансляции у прокариот путем присоединения к инициаторному участку иРНК особой комплементарной регуляторной РНК.
Наконец, существует потенциальная возможность управления скоростью трансляции у прокариот на этапе инициации за счет изменения доступности инициаторной тРНК, которая является обязательной для инициации.
2. Регуляция элонгации. Создается впечатление, что в биосинтезе биополимеров определяющей стадией является инициация, а этап элонгации регулируется в меньшей степени или совсем не регулируется. Тем не менее существует несколько потенциальных возможностей регуляции этапа элонгации в процессе трансляции. Одна из таких возможностей состоит в избирательной трансляции матрицы иРНК за счет специфического набора изоакцепторных тРНК.
Для 20 природных аминокислот существует 61 значащий кодон. По правилу «неоднозначного соответствия» Крика, для их транслирования достаточно около 30 антикодонов. Однако в клетках значительно больше тРНК, некоторые из них специфичны только к одному из кодонов. Если данная аминокислота в данном белке кодируется именно таким кодоном, то наличие или отсутствие соответствующей специфической тРНК будет определять возможность трансляции данной матрицы. В свою очередь, в клетке набор изоакцепторных тРНК может очень тонко регулироваться. Показано, например, что на разных фазах роста Escherichia coli или при переходе от хемотрофного к фототрофному типу питания у Rhodobacter sphaeroides наблюдается резкое изменение набора тРНК. Таким образом, данный способ регуляции можно рассматривать как еще один пример системной регуляции.
Другой пример относится к развитию фагов, в процессе которого наряду с изменением процесса транскрипции блокируется трансляция иРНК организма-хозяина. В некоторых случаях это связано с модификацией рибосом, перестающих «узнавать» иРНК хозяина, однако у эукариот это обусловлено модификацией факторов элонгации, для чего имеются специальные ферменты, осуществляющие фосфор ил ирование или ADP‑рибозилирование, что резко уменьшает сродство данных белков к рибосомам.
Что касается терминации трансляции, то специальные механизмы регуляции в этом случае не обнаружены. Однако необходимо отметить возможность «проскакивания» рибосомы через некоторые «слабые» терминирующие кодоны, что, с одной стороны, позволяет рибосоме транслировать полицистрон-ные матрицы без диссоциации от иРНК, а с другой – обеспечивает образование небольшого количества более длинных полипептидов, могущих выполнять важную функциональную роль.
Регуляция биосинтеза белков путем посттрансляционной модификации
Посттрансляционная модификация белков менее распространена, чем процессинг РНК. Тем не менее известны случаи, когда при развитии некоторых вирусов трансляция полицистронной матрицы приводила к образованию общей полипептидной цепи, разрезаемой в дальнейшем на индивидуальные белки специфическими протеиназами. Кроме того, широко известен процессинг ряда ферментов, превращающий их неактивные формы в активные.
У прокариот наиболее распространенным видом процессинга белков является удаление «сигнального» пептида из молекул секре-тируемых белков. Такие белки и ферменты содержат на NH2-Komje гидрофобный пептид из 15–30 аминокислот, который необходим для транслокации белка через цитоплазм атическую мембрану в процессе его синтеза. После завершения транслокации «сигнальный» пептид удаляется специальной «сигнальной» пептидазой.
К группе процессов посттрансляционной модификации можно отнести ферментативное присоединение коферментов к готовой молекуле апофермента, а также, с некоторой долей условности, и формирование мультимерных белков из нескольких полипептидных цепей с участием белков-шаперонов.
Регуляция круговорота белков путем избирательного протеолиза
Количественный и качественный состав белков в клетке может регулироваться не только на этапе их биосинтеза, но и на этапе деградации. В нормально растущих клетках бактерий за клеточный цикл распадается несколько процентов существующих белков. Более высокая скорость круговорота белка характерна для термофильных организмов. В условиях голодания скорость распада возрастает в несколько раз. Протеолиз клеточных белков выполняет две важные функции. Во-первых, расщепляются ненужные в данный момент ферменты, функционирование которых могло бы вызвать дисбаланс метаболизма, и восполняется ресурс аминокислот. Во-вторых, ликвидируются «ошибочные» белки, возникающие в результате сбоя в биосинтетических процессах или за счет мутаций.
Протеолиз играет особенно важную роль в процессах клеточной дифференцировки, о чем, например, свидетельствует утрата способности к спорообразованию при дефекте синтеза протеиназ. Возможны два основных типа протеолиза: АТР-независимый иАТР-зависимый. Первый активируется в условиях голодания и не требует затраты энергии; второй действует постоянно и весьма избирательно. В эти системы, вероятно, включаются разные ферменты, так как некоторые ингибиторы протеиназ подавляют первый процесс и не влияют на второй. АТР-зависимый протеолиз, по-видимому, включает стадию «узнавания» аномального белка и введение в него метки, которой является специальный белковый агент – убихитин, после чего меченый белок подвергается деградации протенназами.
Механизм «узнавания» аномальных или нефункциональных белков неизвестен, скорее всего, важную роль в нем играют особенности третичной структуры белков, и замена даже одной аминокислоты сильно снижает устойчивость белка к внутриклеточному протеолизу. Последнее обстоятельство может существенно мешать получению микроорганизмов-сверхпродуцентов, у которых повышенное образование целевого продукта обусловлено мутациями по соответствующим ферментам. Такие ферменты будут восприниматьс